涂片检查在临床微生物检验中的应用意义
作者：医院检验科许宏涛
现代科技的飞速发展为检验医学领域带来了新的技术革命，自动化、快速、准确的设备成为了检验医学发展的新方向。近几年，微生物学检验中细菌培养及鉴定的自动化设备亦发展迅速，先进的设备提高了细菌鉴定的效率及准确性。但是，经典检验方法往往是先进设备的验证、校准与补充[1]，细菌培养是金标准，但耗时较长、不易观察菌群相对量及细菌与白细胞关系，而涂片是病原学诊断的经典方法。日本Tomohiro等[2]对患者感染后抗生素有效治疗的研究显示：依据革兰染色结果选择抗生素可以有效降低广谱抗菌药物的应用、提高抗感染效率并减少副反应。可见实验室认真、规范的涂片结果能够为临床提供重要的感染信息。
一、无菌体液标本细菌涂片的诊断价值
无菌体液标本包括血液、脑脊液，胸腔积液、腹腔积液、心包积液、关节腔积液及鞘膜液等。在正常人体中，上述体液应为无菌，在排除污染的情况下，一旦标本中检出细菌应考虑为病原菌。无菌体液标本的正确留取、规范的涂片操作与细菌培养结果间有着高度的相关性。有研究显示[3]，脑脊液、胸腔积液、腹腔积液等穿刺液培养与离心后革兰染色(脑脊液墨汁染色找隐球菌)结果一致性可大于80%，且涂片结果可以在收到标本30min内回报临床，为临床有效抗感染治疗提供了重要依据。
血液(流)感染是最严重的临床感染之一，有些感染可导致患者休克、多器官衰竭、弥漫性血管内凝血，甚至死亡。因此，准确、快速地对病原菌做出诊断、抓住有效的治疗时机才能挽救患者生命。血液标本不能直接涂片，只能进行培养，但当培养仪器报警阳性或血培养瓶内有细菌生长信号时，涂片、染色镜检就显得尤为重要。革兰染色结果(包括细菌形态及排列)应作为危急值内容及时通知临床医师，以便据此推断可能的病原菌并选择相应抗菌药物对患者进行有效治疗。但是，如果形态学提示污染率较高的细菌时，如镜下见到"革兰染色阳性球菌，呈葡萄状排列"，应首先根据报警时间、报阳瓶数初步判断凝固酶阴性葡萄球菌污染的可能，并及时与临床医师沟通了解患者情况，为临床医师的有效判断提供更多有价值信息。当革兰染色未见细菌时，应再做一张涂片，以吖啶橙染色，在荧光显微镜下观察，以提高涂片阳性率[4]。此外，涂片镜检如发现易发生实验室感染的菌株，应警告所有工作人员注意生物安全防范，例如镜检发现"革兰阴性短小杆菌，呈细沙样排列"，查看血培养报阳时间为培养4d左右[5]，应防范布鲁氏菌的可能，即刻与临床沟通、询问病史并在后续操作中注意生物安全。日本Yuki等[6]对血培养阳性瓶革兰染色结果对临床治疗的影响的研究显示，血培养阳性患者革兰染色结果能帮助临床医师更加快速、合理选择抗生素并有效降低患者病死率、减少住院天数。
二、痰标本涂片的价值
痰标本涂片的一个重要价值是判断标本留取的质量。当标本符合下列条件时，可以接收并进行细菌培养：(1)痰液标本：平均每低倍视野鳞状上皮细胞数10个；(2)气管吸出痰液：平均每低倍视野鳞状上皮细胞数10个或20个油镜视野至少能见1个细菌；(3)支气管肺泡灌洗液：鳞状上皮细胞数细胞数的1%[4]。合格痰标本的涂片信息可以预测培养结果，并指导临床用药。陈险峰和周庭银调查[7]例痰标本，合格标本例，合格率为74.8%，合格痰标本涂片与培养结果符合率达到71.19%，而涂片结果早于培养结果至少24h，能够在早期为呼吸道感染的诊断和治疗提供重要信息。涂片发现不合格痰标本如果来自留取标本困难的患者，并非绝对不能接受，例如幼儿患者留取标本时常会混合唾液。操作者应尽量接收一些在痰液中混有黏性或血性痰片的口水痰标本，可在不同部位挑取标本多做痰涂片，甚至清洗后培养。
痰标本涂片革兰染色的另一个重要价值在于发现少见菌或特殊菌感染，为临床感染的诊断和治疗提供新的思路。我国是结核感染高负担国家之一，近年由于不规则用药或混合感染，很多活动性结核患者症状、体征并不典型，临床医师在送检痰标本进行涂片检测时经常忽视痰涂片找抗酸杆菌；有经验的检验医师可以在痰涂片革兰染色的涂片中发现"鬼影细胞"，而高度怀疑抗酸杆菌的感染，并以抗酸染色、分子生物学技术(如结核PCR)或结核分枝杆菌培养确证，从而为临床感染诊断提供重要信息。奴卡菌是另一类生长速度较慢、弱抗酸染色呈阳性、治疗首选磺胺类药物的细菌，早期发现能够对患者进行有效治疗并降低广谱抗生素的应用，若痰涂片革兰染色发现革兰染色阳性、具有短或长的分枝菌丝可疑菌的涂片应以改良Kinyoun抗酸染色复查，并初步报告临床医师为可疑奴卡菌，待菌落可见时再进行后期鉴定；这样临床应用有效抗生素可提前48～72h。
三、阴道分泌物涂片检查的价值
临床标本涂片革兰染色镜检的另一个重要价值是生殖道感染细菌来源的判断，特别是对女性细菌性阴道病(bacterialvaginosis,BV)或细菌性阴道炎(bacterialvaginitis)具有重要的辅助诊断价值[7]。BV患者阴道的正常菌群被破坏，从主要为乳杆菌等优势菌群变为由阴道加德纳菌、厌氧菌(普雷沃菌、动弯杆菌等)混杂的菌群，伴随阴道分泌物pH值4.5、分泌物加KOH后产生氨味(鱼腥味)，线索细胞的存在也可以辅助诊断BV，Rebecca等[8]最早报道了BV的实验室诊断标准。此外，生殖道标本革兰染色镜检还应注意观察：(1)是否存在淋病奈瑟菌，及菌体是否位于白细胞内；(2)发现酵母样真菌孢子可辅助诊断霉菌性阴道炎；(3)是否存在杜克雷嗜血杆菌；(4)湿片法观察阴道毛滴虫。
四、便标本涂片检查的意义
粪便标本正常菌群含量很高，临床标本涂片检查很难鉴别病原菌，因而粪便标本一般不直接做涂片检查。但当怀疑霍乱弧菌所致腹泻或患者存在菌群失调时应直接涂片检查。
粪便标本涂片检查另一重要意义是观察菌群是否平衡，也就是不同菌种比例有否失调。正常粪便中革兰阴性杆菌所占比例最高，其次为革兰阳性球菌或杆菌，有或无少量酵母样真菌。当患者经历放化疗、应用免疫抑制剂或系统感染并最终应用大量抗生素进行抗感染治疗后，抗菌谱范围内的细菌被抑制，而其他未覆盖细菌或真菌大量繁殖，患者机体微生态失衡、产生"二重感染"，而粪便菌群变化是机体微生态失衡的敏感标志；临床较常出现由难辨梭菌、金黄色葡萄球菌或白色假丝酵母菌大量繁殖而引起的假膜性肠炎。因而，虽然粪便标本涂片检查不能辨认菌种，但能对肠道菌群是否失衡做出快速的判断，有利于临床对此类患者尽快调整用药。
五、真菌涂片法对侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)的预警价值
近年来IFI比例不断上升，法国Dounia等至年的研究显示[9]，被调查的例IFI患者中，念珠菌血症占43.4%，卡氏肺孢子虫肺炎26.1%，侵袭性曲霉病23.9%，隐球菌病5.2%，毛霉菌病1.5%，IFI死亡率达到27.6%；真菌感染无特异性临床表现、微生物检测方法有限都是IFI病原学检测的困难，张秀珍报道[1]真菌感染患者50%不能在生前获得阳性培养结果，患者因错过最佳治疗时机而失去生命。微生物室的一项重要任务是提高真菌感染的检出率。
真菌涂片法能够为临床提供最直接的诊断依据，操作简便、成本低，可在同一标本的不同部位做多个涂片，以增加病原体的检出率；这一点优于培养的方法，因为培养多只能挑取一个部位的标本进行操作，而存在漏检的机会。此外，真菌感染也是临床常见的二重感染，菌群失调所导致的内源性感染是真菌感染的重要途径，涂片是洞察菌群比例是否失调的最佳方式，而培养对非无菌部位的标本不能判断阳性菌株的真实临床价值。无菌体液标本、组织标本中发现真菌菌丝体具有重要的临床价值；此外，涂片可以对菌丝体进行观察，根据其特征进行初步分类。国内金美花[10]对G试验、培养、涂片对IFI的诊断进行了评价，认为涂片法特异性最高，达到94.12%，G试验具有相对高的敏感性(86.44%)和特异性(83.02%)，但不能区分真菌种属，而培养法耗时较长；若3种方法联合可以提高对IFI检测的敏感性和特异性。
六、根据临床需要选择恰当的染色方法
微生物室的形态学检查是一门基本功。根据不同的标本特征及临床需求，微生物室工作人员应选择适当的检查方法。不染色标本的检查包括标本中有形成分的检查及细菌动力的观察，应用于腹泻患者的病原菌筛查时，对可疑霍乱弧菌感染患者的粪便标本应用湿片法进行菌群动力观察是典型的非染色法。染色法包括革兰染色、抗酸染色、荧光染色、鞭毛染色、墨汁荚膜染色、瑞氏染色、瑞氏-吉姆萨复合染色、异染颗粒染色、荚膜染色、乳酸酚棉兰染色、六胺银染色及应用于布鲁菌初步鉴定的科茨洛夫斯基染色等[11]。革兰染色应用范围最广，能够对多数标本的菌体形态、菌群比例及标本特征(白细胞数量及菌体与白细胞伴行还是被吞噬等)进行检测及评估；但当需要对丝状真菌培养物进行镜检时，应选择乳酸酚棉兰染色；而当遇到免疫缺损患者怀疑肺孢子菌病时，可应用痰液或气管分泌物涂片、支气管-肺泡灌洗液沉渣涂片等，以六胺银染色法等进行卡氏肺孢子菌检测。对不同致病菌选择正确方法并多种染色方法有机结合，可较好地提高涂片法的检出率和准确率。
七、问题和挑战
微生物形态学检查对于病原体的诊断有重要意义。但我国在细菌形态学检验方面还相对落后，主要与专业教材及书籍中细菌形态学内容描写相对较少有关。此外，形态学检查要求工作人员有一定经验积累，否则一些少见菌很难被发现并辨认。近年来，随着现代化细菌鉴定仪器和分子生物学技术的发展[12]，人们似乎更愿意依赖现代化技术去检出并鉴定病原微生物。而涂片检查最重要的意义在于标本直接制片染色显微镜下观察并对感染性病原体进行初步诊断。此外，细菌细胞大小、形态、细胞排列方式、染色性均可以作为细菌最终鉴定结果的重要依据和参照。
微生物实验室应重视经典的、传统的细菌涂片，并努力提高技术水准，同时掌握现代先进的微生物检测、鉴定设备，只有将二者有机结合，才能为临床病原的发现及微生物鉴定提供新的可能，并为临床医师提供更多感染信息以提高微生物实验室检验报告的诊断价值。
参考文献
[1]张秀珍.临床细菌室要充分发挥涂片的作用[J].中国感染与化疗杂志，,7(2):-.
[2]TomohiroT,SanefumiT,SoichiS,etal.Gram-stain-basedantimicrobialselecionreducescostandoveruse